從國際聯盟 MiBioGen 的 GWAS 數據集中選擇與人類腸道微生物組組成相關的 SNPs 作為 IV。GWAS 數據集中包含了來自美國等 18 340 名參與者的 16S 核糖體 RNA 基因測序圖譜和基因分型數據，共有 211 個分類群符合微生物數量性狀基因座定位分析的條件。為控制種群結構異質性對因果效應推斷有效性的潛在影響，本研究在孟德爾隨機化分析中限定遺傳 IV 來源于歐洲群體。在本研究中，屬是最低的分類級別。該研究獲得寧夏醫科大學倫理委員會的批準(編號：寧醫大倫理第 2022-N035 號)。 11.1.2 結局數據

　　對于 CVDs 數據集，擴張型心肌病、冠心病、高血壓病和深靜脈血栓四類疾病分別代表心肌病變、動脈粥樣硬化、血流動力學異常、凝血功能障礙。從全基因組關聯研究 GWAS 數據庫中(GWAS ID：finn-b-FG_CVDs)獲得了 CVDs 數據，匯總高血壓(GWAS ID：ukb-b-14177)、擴張型心肌病(GWAS ID：ebi-a-GCST90018834)、冠心病(GWAS ID：ebi-a-GCST000998)、血栓(GWAS ID：ukb-a-65)數據。病例組與對照組的結局數據分布情況見表 1。 231.2 IV 選擇

　　為了確保 GM 與 CVDs 之間因果關系結論的真實性和準確性，使用以下質量控制步驟來選擇最佳 IV：1)選擇與 GM 顯著相關，顯著性閾值(P<1×10??)SNP 作為 IV;2)需確保所包含的 IV 之間不存在連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)。目前的研究通過結塊過程(clump_r2 =0.01，clump_kb=5 000)評估 SNPs 之間的 LD;3)確保 SNPs 對暴露的影響與對結果的影響對應于相同的等位基因，刪除回文 SNPs(例如 A/T 或 G/C 等位基因);4)使用 PhenoScanner 數據庫中在 R²>0.80 的閾值上刪除與混雜因素和 CVDs 結局相關的 SNP。用公式 F=beta²/se² 計算 F 統計量;排除 F<10 的 SNP，得到可靠的 SNP 作為 IV。

　　41.3 數據分析

　　數據分析使用 R 4.2.1 軟件中 TwoSampleMR 包。通過 IV 估計風險因素對復雜疾病的因果影響。用 5 種方法進行孟德爾隨機化分析：以 IVW 為主要方法和研究依據，以孟德爾隨機化、加權中位數、Simple mode 和加權眾數為輔助方法。以 P<5×10??為標準提取 IV。通過留一法檢驗結果的水平多效性。由于人群和 SNPs 的差異，孟德爾隨機化分析的異質性檢驗中 F<10 被認為無弱 IV 偏倚。 52 結果

　　以屬為篩選標準，共篩選出 7 個屬，77 個符合條件的 SNPs。真桿菌 4 種：瘤胃真桿菌、短真桿菌、裂鏈真桿菌和產糞固醇真桿菌。瘤胃球菌屬 1 種：扭鏈瘤胃球菌。結果表明，以擴張性心肌病為結局，真桿菌菌屬中共有 17 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.326，95% CI=1.072～1.639，P=0.009)。以高血壓為結局，短真桿菌屬中共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.984～0.999，P=0.030)。以深靜脈血栓為結局，瘤胃真桿菌屬共 15 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.003，95% CI=1～1.005，P=0.02)。以冠心病為結局，在瘤胃真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.155，95% CI=1.007～1.325，P=0.039)。其中另一種扭鏈瘤胃球菌共 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=0.992，95% CI=0.986-0.999，P=0.031)。以 CVDs 為結局，裂鏈真桿菌屬共有 8 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.058，95% CI=1.002～1.116，P=0.041)。在產糞固醇真桿菌屬中共 14 個 SNPs 可作為 IV，IVW(OR=1.09，95% CI=1.002～1.184，P=0.044)，見表 2。 67

　　以擴張型心肌病為結局，在 R²>0.80 閾值上通過 PhenoScanner 去除與混雜因素相關的 9 個 SNPs 和與結局相關的及回文 SNPs，共提取 157 個 SNP，真桿菌菌屬共 17 個 SNPs 可作為 IV。以高血壓為結局，共提取 158 個 SNP。短真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV。深靜脈血栓疾病為結局，刪除 9 個 SNPs 相關及回文 SNPs，提取 157 個 SNP。扭鏈瘤胃球菌屬共 9 個 SNPs 作為 IV。瘤胃真桿菌屬共 15 個 SNPs 可作為 IV。以冠心病為結局，共提取 157 個 SNP。瘤胃真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 IV。另一種扭鏈瘤胃球菌屬中共 8 個 SNPs 可作為 IV。以 CVDs 為結局，刪除相關及回文 SNPs 共提取 157 個 SNPs。裂鏈真桿菌屬共 8 個 SNPs 可作為 Ⅳ。產糞固醇真桿菌共有 14 個 SNPs 可作為 Ⅳ，見圖 1。 8

　　GM 和 CVDs 的森林圖可看出，產糞固醇真桿菌與 CVDs 風險呈正相關(P<0.05)，為危險因素;瘤胃真桿菌與冠心病呈正相關(P<0.05)，為危險因素。埃爾格尼斯氏芽孢桿菌可降低擴張型心肌病風險(P<0.05)，短真桿菌是高血壓的保護因素(P<0.05)。瘤胃球菌是深靜脈血栓的保護因素(P<0.05)，見圖 2。 93 討論

　　本研究結果表明不同的 GM 對 CVDs 具有不同的影響。GM 可以從 3 種不同的機制來影響 CVDs 的發展：GM 可以通過影響各種免疫細胞來激活免疫系統從而加速 CVDs 的形成 [8];GM 產生的 TAMO 物質通過激活血小板活性促進 CVDs 的形成 [9];在膳食中物質通過代謝途徑和免疫反應影響動脈粥樣硬化的發生和發展，因此探究其具體 GM 種類分別對 CVDs 的機制很有必要 [10-11]。真桿菌屬指一組由革蘭氏陽性、均勻或多形的不形成孢子的、明顯厭氧的和化能有機營養的細菌桿狀體組成的細菌 [12]。有實驗表明在肥胖患者和高脂飲食小鼠模型中均發現真桿菌屬的減少與動脈粥樣硬化病變的發展呈負相關關系 [13-14]。在本研究中，真桿菌屬對于 CVDs 是雙刃劍，對擴張型心肌病等屬于危險因素;在綜合的 CVDs 數據集中又是保護因素。研究中真桿菌屬的遺傳預測豐度升高與擴張性心肌病和冠心病風險呈正相關，提示真桿菌屬參與兩類 CVDs 的病理進程。既往研究也強調代謝功能的宿主保護作用 [15]。另有研究表明在 TMAO 通路上，真桿菌屬的部分菌種可將膳食膽堿氧化為 TMAO [16]。另一方面，真桿菌屬參與腸道初級膽汁酸向次級膽汁酸的轉化，與擴張性心肌病的病理特征吻合。最后，從炎癥與免疫調節角度來說，真桿菌屬的脂多糖結構誘導全身炎癥進而加重血管內皮損傷和心肌纖維化 [17]。此外，瘤胃球菌屬的遺傳預測豐度升高與冠心病和深靜脈血栓風險呈負相關 [18]。 11121315

　　綜上所述，GM 和 CVDs 之間具有因果關系，改善 GM 可能對預防和治療 CVDs 有一定的臨床意義。然而本研究亦存在局限性，由于在分析中使用匯總統計量而非原始數據，無法進行亞組分析以探索是否存在非線性關系。為了進行敏感性分析和水平多效性檢驗，有必要將更多的遺傳變異作為工具變量。 164 結論

　　GM 和 CVDs 之間具有因果關系，改善 GM 可能對預防和治療 CVDs 有一定的臨床意義。 18附：表格與圖表說明

　　表 1 病例組與對照組的結局數據分布情況

　　結局n病例組對照組SNPs 數量

　　CVDs456 468101 866116 926116 926

　　高血壓111 14812 171450 8399 851 867

　　擴張型心肌病355 3811 444353 93719 080 278

　　冠心病86 99522 23364 7622 415 020

　　深靜脈血栓337 1596 767330 39210 894 59610

　　表 2 腸道微生物與 CVDs 因果關系

　　結局GM (暴露)方法nβSEP 值

　　CVDs裂鏈真桿菌MR-egger80.1410.1390.348

　　Weighted median80.0610.0360.089

　　IVW80.0560.0280.041

　　simple mode80.0720.0560.238

　　Weighted mode80.0720.0510.204

　　產糞固醇真桿菌MR-egger140.5540.1640.006

　　Weighted median140.1580.0590.007

　　IVW140.0850.0420.044

　　simple mode140.1930.1130.113

　　擴張型心肌病瘤胃真桿菌MR-egger170.3090.4030.455

　　Weighted median170.2190.1520.149

　　IVW170.2820.1080.009

　　simple mode170.2030.2780.476

　　Weighted mode170.2030.2850.486

　　高血壓病短真桿菌MR-egger8-0.0270.0130.091

　　Weighted median8-0.0080.0040.079

　　IVW8-0.0080.0040.030

　　冠心病瘤胃真桿菌simple mode8-0.0060.0070.431

　　Weighted mode8-0.0060.0060.356

　　MR-egger8-0.0960.2560.721

　　Weighted median80.1840.0900.041

　　IVW80.1440.0700.039

　　扭鏈瘤胃球菌simple mode80.1850.1410.230

　　Weighted mode80.1890.1360.207

　　MR-egger8-0.3050.2430.256

　　Weighted median8-0.2230.1360.101

　　IVW8-0.2140.0990.031

　　simple mode8-0.2130.1990.320

　　Weighted mode8-0.2410.1770.214

　　深靜脈血栓扭鏈瘤胃球菌MR-egger9-0.0060.0090.533

　　Weighted median9-0.0070.0030.034

　　IVW9-0.0080.0030.018

　　simple mode9-0.0060.0050.280

　　Weighted mode9-0.0060.0040.191

　　瘤胃真桿菌MR-egger150.0020.0040.678

　　Weighted median150.0030.0010.037

　　IVW150.0030.0010.029

　　simple mode150.0030.0030.226

　　Weighted mode150.0030.0020.19414

　　圖 1 GM 與 CVDs 因果關系的散點圖(原文圖 1 對應內容)

　　通過散點圖展示不同菌屬與各類 CVDs 的關聯強度，如埃爾格尼斯氏芽孢桿菌與擴張型心肌病、瘤胃真桿菌與冠心病等的相關性分布。 17圖 2 與心血管類疾病有因果關系的腸道微生物森林圖(原文圖 2 對應內容)

　　以森林圖形式呈現各菌屬作為危險因素或保護因素的 OR 值及置信區間，例如產糞固醇真桿菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184)為 CVDs 危險因素，短真桿菌(OR=0.992，

　　1. 研究目的

　　使用孟德爾隨機化研究方法驗證腸道微生物群(GM)與心血管疾病(CVDs)之間的因果關系1。

　　2. 數據來源

　　暴露數據：來自 MiBioGen 聯盟的 GWAS 數據集，包含 18340 名參與者的 16S 核糖體 RNA 基因測序圖譜和基因分型數據，篩選與 GM 相關的 SNPs 作為工具變量，限定遺傳 IV 來源于歐洲群體，以 “屬” 為最低分類級別2。

　　結局數據：從 GWAS 數據庫中獲得 CVDs 數據，包括擴張型心肌病、高血壓、冠心病、深靜脈血栓，具體病例組與對照組分布見表 13。

　　3. 研究方法

　　IV 選擇：選擇與 GM 顯著相關(P<1×10??)、無連鎖不平衡、非回文且與混雜因素及結局無關的 SNPs，計算 F 統計量并排除 F<10 的弱工具變量4。

　　數據分析：使用 R 軟件 TwoSampleMR 包，采用 IVW、加權中位數、Simple mode、加權眾數、MR-Egger 等方法進行孟德爾隨機化分析，以 P<5×10??提取 IV，通過留一法檢驗水平多效性5。

　　4. 主要結果

　　擴張型心肌病：瘤胃真桿菌(OR=1.326，95% CI=1.072~1.639，P=0.009)可能增加其風險6。

　　高血壓：短真桿菌(OR=0.992，95% CI=0.984~0.999，P=0.030)有保護作用6。

　　深靜脈血栓：扭鏈瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.018)有保護作用，瘤胃真桿菌(OR=1.003，95% CI=1~1.005，P=0.029)增加其風險7。

　　冠心病：瘤胃真桿菌(OR=1.155，95% CI=1.007~1.325，P=0.039)增加其風險，扭鏈瘤胃球菌(OR=0.992，95% CI=0.986~0.999，P=0.031)有保護作用7。

　　總體 CVDs：裂鏈真桿菌(OR=1.058，95% CI=1.002~1.116，P=0.041)和產糞固醇真桿菌(OR=1.09，95% CI=1.002~1.184，P=0.044)可能增加其風險7。

　　5. 討論

　　作用機制：GM 可通過激活免疫系統、產生 TMAO 激活血小板、影響膳食代謝與免疫反應等機制影響 CVDs 發展8。

　　研究意義：證實 GM 與 CVDs 存在因果關系，為通過調節 GM 預防和治療 CVDs 提供依據9。

　　局限性：使用匯總統計量而非原始數據，無法進行亞組分析及探索非線性關系，需更多遺傳變異作為工具變量9。

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